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RAD-seq (Restriction site Associated DNA-Sequencing)

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작성자 김지은 작성일14-05-14 09:34 조회4,311회 댓글0건

본문

 
<차세대 염기서열 분석기 발전 역사>
 
 
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Illumina Introduces the HiSeq X™ Ten Sequencing System

Breaks Barriers with World’s First $1,000 Genome,

Enables ‘Factory’ Scale Sequencing for Population and Disease Studies

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the HiSeq X™ Ten is a set of ten ultra-high-throughput sequencer, 

 

purpose-built for large-scale human whole-genome sequencing.

 

<NGS sequencer 비교>

 
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<Genotyping 연구 방향>
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<RAD-Seq>
(Restriction site Associated DNA-Sequencing) 
 
?RAD-Sequencing : 2008Oregon University에서 처음으로 개발
?RAD-Seq: Illumina
?RAD-seq(restriction site-associated DNA marker sequencing)
?target genome(0.1% to 15%)의 조각의 정보(interrogation)를 얻을수 있는 genotyping 방법
?모든base-pair에 대한 정보(interrogation)를 얻는 것보다 짧은DNA 단편(특정 제한효소 인식 부위주변DNA 조각(=RAD tags))인식하여 읽어 들임.
?IlluminaMiSeqsystem : SNP discovery를 위한RAD tag sequence 생산에 이용
 
6.PNG

 
 
<RAD-sequencing 원리>

 

1. 특정RE으로 gDNAfragmentation 시킨다.

2. sample를 구분하기 위한barcode가 포함된P1 adapterfragment 양쪽 끝에 ligation,하나의 튜브에 섞어준다.

3. DNArandom하게shearing한 다음, 300~700bp 범위의fragment만 선별한다.

4. Y-shapeP2 adapter를 선별된 모든fragmentligation시킨다.

5. P1P2 adapter 일부sequence로 구성된primer 1, 2를 이용하여PCR enrichment시킨다.

6. Sequencing을 통해 생성된read는 동일barcode끼리 구분한다.

7. RE site를 기준으로read나열, samplesequence 차이를 확인한다.

 

 
trugrade-figure1.jpg
*출처 : http://www.idtdna.com/pages/decoded/decoded-articles/your-research/decoded/2012/09/21/reduced-barcode-contamination-using-oligonucleotides-with-trugrade-processing
 
 
floragenex-rad-dna-sequencing-bioinformatics-rad-diagram.png

 

<RAD-sequencing용>
 
?RAD-sequencingrestriction site 주위sequence뿐 아니라local assembly가 가능한 방법으로
(Wheat), 보리(Barley)와 같이genome size가 매우 크거나, complexity가 높아
de novo assembly어려운 종에 적용하기 적합한 방식
?반면 애기장대나 벼처럼reference genome이 잘 구축되어 있고size가 크지 않은 경우
resequencing에 비해서 유리한 방법은
?기존의 shotgun library는 많은 경험과 정형화된kit 개발을 통해 안정적인 제작이 가능하지만
RAD library의 경우 고려해야 할 사항이 많아 결과에 대한 보장이 아직까지는 어려운
?우선 어떤 제한효소를 선택하느냐에 따라fragment 수가 달라질 수 있어 얻고자 하는 SNP의 수에 조정 필요
?또한 모든fragment5’ 말단에는 동일한restriction enzyme site가 위치하여
sequencing diversity가 현격하게 떨어지므로barcode의 길이나 서열변화를 통해 이를 보완해야.

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